“Uma Noite no Museu – O Retorno de Kahmunrah” é uma nova aventura animada baseada na famosa franquia de filmes. O trabalho de verão de Nick Daley como guarda noturno do Museu Americano de História Natural é um trabalho desafiador para qualquer aluno do ensino médio. Por sorte, ele está seguindo os passos do pai e já conhece a antiga placa do museu que dá vida a tudo quando o sol se põe. Nick fica feliz de ver os velhos amigos, entre eles Teddy, Sacagawea e Rexy. Mas, quando o governante maníaco Kahmunrah escapa com o plano de acessar o submundo egípcio e libertar seu Exército da Morte, cabe ao Nick impedir esse soberano do mal e salvar o museu de uma vez por todas.

O guarda-noturno do Museu de História Natural Larry Daley é agora um empresário bem sucedido. Logo depois de descobrir que seus amigos do museu foram enviados para o Instituto Smithsonian, Larry recebe uma chamada de socorro de Jedediah, avisando que quatro dos maiores vilões da história estão planejando comandar o Smithsonian e em seguida o mundo. Larry junta forças com velhos e novos amigos para acabar com os planos do quarteto.

O segurança Larry Daley torna-se diretor de operações do turno da noite do Museu de História Natural de Nova York. Certo dia, ele percebe que os objetos de exposição do museu estão estranhos. Ele descobre, então, que a peça mais importante está sofrendo um processo de deterioração. Para tentar salva-la, Larry, seu filho e a turma do museu vão para Londres pedir orientação do faraó que está em exposição no museu local.

O novo segurança do Museu de História Natural de Nova York faz uma grande descoberta. Por causa de uma antiga maldição egípcia, os animais, pássaros, insetos e outras peças em exibição ganham vida quando os visitantes vão embora. Soldados romanos, pistoleiros do velho oeste, o ex-presidente Theodore Roosevelt e muitas outras figuras históricas entram em ação em uma aventura fantástica.